填空題基因克隆中三個基本要點是：（）；（）和（）。

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5.問答題

我們實驗室研究生做了一個如下的實驗：將pdc基因（丙酮酸脫羧酶）克隆到pUC18載體中，以便在E.coli TOP10中表達(dá)，這個pdc基因兩側(cè)具有BamHI的位點，因此計劃將它從BamHI的位點插入載體中。實驗嚴(yán)格按分子克隆實驗手冊中進(jìn)行：載體用BamHI切割后，立即用堿性磷酸酶處理，接著將處理過的載體同用BamHI切割的pdc基因混合，加入T4連接酶進(jìn)行溫育，連接后，將DNA同處理過的可以接受外源DNA的E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞混合。最后將混合物涂布在加有氨芐青霉素、IPTG和x-gal固體培養(yǎng)基的平板上。 
實驗中同時設(shè)置了4個對照： 
對照1：將未同任何載體接觸過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 對照2：將未切割載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
對照3：將經(jīng)切割（但未用堿性磷酸酶處理）并用T4連接酶連接（但沒有pdc基因）的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
對照4：將經(jīng)切割（并用堿性磷酸酶處理過）并用T4連接酶連接（但沒有pdc基因）的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
在進(jìn)行第一次實驗時，感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的，結(jié)果，在所有的平板上都長出了多到無法計數(shù)的菌落（見下表1）。在第二次實驗中，自己制備感受態(tài)細(xì)胞，但這一次，所有的平板上都沒菌落生長（見下表1）。接著又進(jìn)行了第三次實驗，這次得到了轉(zhuǎn)化子（見下表1）。從實驗平板上挑出12個菌落，分離質(zhì)粒DNA，并用BamHI進(jìn)行切割，其中9個克隆產(chǎn)生大小同載體pUC18一樣的單一的一條帶，另3個克隆中切出一個pdc基因，實驗終于獲得成功。

第三次實驗如何進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的挑選？并說明其原理？